总糖和还原糖的测定-分光光度计 紫外分光光度计 上海奥析科学仪器PK10计划
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总糖和还原糖的测定

2014-3-27 16:46:00      点击:

一、目的要求:

    掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。

二、实验原理

在NaOH和丙三醇存在下,3,5-二硝基水杨酸(DNS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。

三、试剂和器材

1、试剂

(1)1 mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml,即含葡萄糖为1.0mg/ml。

(2)3,5—二硝基水杨酸试剂:称取6。3 g 3,5—二硝基水杨酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中(182 g酒石酸钾纳溶于500 ml水中),再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中,搅拌溶解,冷却后定容到1000 ml贮于棕色瓶中。

(3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘,10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

(4)6N NaOH:称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。

(5)0.1% 酚酞指示剂。 

6)6 mol/L HCl溶液

2、材料

小麦淀粉或玉米淀粉。

3、器材

分光光度计,天平,水浴锅,电炉,试管若干等。

四、操作方法 

1、葡萄糖标准曲线制作

取8支15mm×180mm试管,按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

试剂

管号

0

1

2

3

4

5

6

7

8

葡萄糖标准液(ml)

0

0.2

0.4

0。6

0.8

1。0

1.2

1.4

1.6

蒸馏水(ml)

2.0

1.8

1。6

1。4

1。2

1.0

0.8

0.6

0.4

水杨酸溶液(ml)

1。5

1.5

1。5

1。5

1.5

1。5

1.5

1。5

1。5

葡萄糖含量(mg)

0

0.2

0。4

0.6

0.8

1.0

1。2

1.4

1.6

将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5 min,取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入21。5 ml蒸馏水,摇匀。

λ=540nm处测定吸光度

 

 

 

 

 

 

 

 

 

以葡萄糖含量(mg)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。

2、样品中还原糖的提取

准确称取 0.5g小麦(淀)粉,放在100ml烧杯中,先以少量蒸馏水(2 ml)调成糊状,然后加入40ml蒸馏水,混匀,于50℃恒温水浴中保温20min,不时搅拌,使还原糖浸出混。过滤,将滤液全部收集在50ml的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。

3、样品总糖的水解及提取

准确称取0。5g小麦(淀)粉,放在锥形瓶中,加入6mol/L HCl 10ml,蒸馏水15ml,在沸水浴中加热0。5h,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并定容到100ml,过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液,用于总糖测定。

4、样品中含糖量的测定

试剂

空白

还原糖

总糖

样品溶液(ml)

0

1。0

1.0

蒸馏水(ml)

2。0

1.0

1。0

水杨酸(ml)

1。50

1.50

1。50

将各管溶液混合均匀,在沸水中加热5 min,取出后立即用冷水冷却到室温,再向每管加入21.5 ml蒸馏水,摇匀。

λ=540nm处测定吸光度

 

 

 

样品溶液中还原糖和总糖

 

 

 

测定后,取样品的光吸收值在标准曲线上查出相应的糖量。

五、结果处理

    按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量:

                   

式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;

V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml;

            m──样品重量,g;

1000──mg换算成g的系数。

思考题

1。 比色时为什么要设计空白管?

2. 比较费林试剂比色法与3,5-二硝基水杨酸比色法测定可溶性淀粉中还原糖和总糖的结果,这两种方法各有何优点?

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