分光光度计在食品中苯并(a)芘的测定方法 GB -分光光度计 紫外分光光度计 上海奥析科学仪器PK10计划
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分光光度计在食品中苯并(a)芘的测定方法 GB

2014-5-4 15:32:59      点击:
第—法 荧光分光光度法
1 原理 
  样品先用有机溶剂提取,或经皂化后提取,再将提取液经液—液分配或色谱柱净化,
然后在乙酰化滤纸上分离苯并(a)芘, 因苯并(a)芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点,将
分离后有苯并(a)芘的滤纸部分剪下,用溶剂浸出后,用荧光分光光度计测荧光强度与标
准比较定量。
2 试剂
2.1 苯:重蒸馏。
2.2 环己烷(或石油酸,沸程: 30~60℃):重蒸馏或经氧化铝柱处理无荧光。
2.3 二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。
2.4 无水乙醇:重蒸馏。
2.5 95%乙醇。
2.6 无水硫酸钠。
2.7 氢氧化钾。
2.8 丙酮:重蒸馏。
2.9 展开剂:95%乙醇-二氯甲烷(2:1)。
2.10 硅镁型吸附剂: 将60~100目筛孔的硅镁吸附剂经水洗四次(每次用水量为吸附剂质
量的4倍)于垂融漏斗上抽滤干后,再以等量的甲醇洗(甲醇与吸附剂量克数相等),抽滤干
后,吸附剂铺于干净瓷盘上,在130℃干燥5h后,装瓶贮存于干燥器内,临用前加5%水减
活,混匀并平衡4h以上,最好放置过夜。
2.11 层析用氧化铝(中性):120℃活化4h。
2.12 乙酰化滤纸:将中速层析用滤纸裁成30×4cm的条状,逐条放入盛有乙酰化混合液
(180ml苯、130ml乙酸酐、0.1ml硫酸)的500ml烧杯中,使滤纸条充分地接触溶液,保持溶
液温度在21℃以上,时时搅拌,反应6h,再放置过夜。取出滤纸条,在通风橱内吹干,再
放入无水乙醇中浸泡4h,取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上,在室温内风干压平备用。
一次可处理滤纸15~18条。
2.13 苯并(a)芘标准溶液:精密称取10.0mg苯并(a)芘,用苯溶解后移入100ml棕色容量
瓶中,并稀释至刻度,此溶液每毫升相当于苯并(a)芘100μg。放置冰箱中保存。
2.14 苯并(a)芘标准使用液:吸取1ml苯并(a)芘标准溶液置于10ml容量瓶中,用苯稀释
至刻度,同样反复用苯稀释,最后配成每毫升相当于1.0及0.1μg苯并(a)芘两种标准使用
液,放置冰箱中保存。
3 仪器
3.1 脂肪提取器。 
3.2 层析柱:内径10mm,长350mm,上端有内径25mm、长80~100mm漏斗,下端具有活塞。
3.3 层析缸(筒)。
3.4 K-D全玻璃浓缩器。
3.5 紫外光灯:带有波长为365nm或254nm的滤光片。
3.6 回流皂化装置:锥形瓶磨口处连接冷凝管。
3.7 组织捣碎机。
3.8 荧光分光光度计。
4 操作方法
4.1 样品提取
4.1.1 粮食或水分少的食品:称取40~60g粉碎过筛的样品,装入滤纸筒内,用70ml环己
烷润湿样品,接收瓶内装6~8g氢氧化钾、100ml95%乙醇及60~80ml环己烷,然后将脂肪
提取器接好,于90℃水浴上回流提取6~8h,将皂化液趁热倒入500ml分液漏斗中,并将滤
纸筒中的环己烷也从支管中倒入分液漏斗,用50ml95%乙醇分二次洗接收瓶,将洗液合并
于分液漏斗。加入100ml水,振摇提取3min,静置分层(约需20min),下层液放入第二分液
漏斗,再用70ml环己烷振摇提取一次,待分层后弃去下层液,将环己烷层合并于第一分液
漏斗中,并用6~8ml环己烷淋洗第二分液漏斗,洗液合并。
  用水洗涤合并后的环己烷提取液三次, 每次100ml,三次水洗液合并于原来的第二分
液漏斗中,用环己烷提取二次,每次30ml,振摇0.5min,分层后弃去水层液,收集环己烷
液并入第一分液漏斗中,于50~60℃水浴上,减压浓缩至40ml,加适量无水硫酸钠脱水。
4.1.2 植物油:称取20~25g的混匀油样,用100ml环己烷分次洗入250ml分液漏斗中,以环己
烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次,每次40ml,振摇1min,合并二甲基甲酰胺提取液,用
40ml经二甲基甲酰胺饱和过的环己烷提取一次,弃去环己烷液层。二甲基甲酰胺提取液合
并于预先装有240m12%硫酸钠溶液的500ml分液漏斗中,混匀, 静置数分钟后,用环己烷
提取二次,每次100ml,振摇3min,环己烷提取液合并于第一个500ml分液漏斗。也可用二
甲基亚砜代替二甲基甲酰胺。
  用40~50℃温水洗涤环己烷提取液二次,每次100ml,振摇0.5min,分层后弃去水层
液,收集环己烷层,于50~60℃水浴上减压浓缩至40ml。加适量无水硫酸钠脱水。
4.1.3 鱼、肉及其制品:称取50~60g切碎混匀的样品,再用无水硫酸钠搅拌(样品与无
水硫酸钠的比例为1:1或1:2,如水分过多则需在60℃左右先将样品烘干),装入滤纸筒内,
然后将脂肪提取器接好,加入100ml环己烷于90℃水浴上,回流提取6~8h,然后将提取液
倒入250ml分液漏斗中,再用6~8ml环己烷淋洗滤纸筒,洗液合并于250ml分液漏斗中,以下
按4.1.2自“以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次”起依法操作。
4.1.4 蔬菜:称取100g洗净、晾干的可食部分的蔬菜,切碎放入组织捣碎机内,加150ml
丙酮,捣碎2min。在小漏斗上加少许脱脂棉过滤,滤液移入500ml分液漏斗中,残渣用50ml丙
酮分数次洗涤,洗液与滤液合并,加100ml水和100ml环己烷,振摇提取2min,静置分层,环己
烷层转入另一500ml分液漏斗中,水层再用100ml环己烷分二次提取,环己烷提取液合并于
第一个分液漏斗中,再用250ml水,分二次振摇、洗涤,收集环己烷于50~60℃水浴上减压
浓缩至25ml, 加适量无水硫酸钠脱水。
4.1.5 饮料(如含二氧化碳先在温水浴上加温除去):吸取50~100ml样品于500ml分液漏
斗中,加2g氯化钠溶解,加50ml环己烷振摇1min,静置分层,水层分于第二个分液漏斗中,
再用50ml环己烷提取一次,合并环己烷提取液,每次用100ml水振摇、洗涤二次,收集环己
烷于50~60℃水浴上减压浓缩至25ml,加适量无水硫酸钠脱水。
4.1.6 糕点类:称取50~60g磨碎样品,装于滤纸筒内,以下按4.1.1自“用70ml环己烷润
湿样品”起依法操作。
在4.1.1、4.1.3~4.1.6各项操作中,均可用石油醚代替环己烷,但需将石油醚提取
液蒸发至近干,残渣用25ml环己烷溶解。
4.2 净化
4.2.1 于层析柱下端填入少许玻璃棉,先装入5~6cm的氧化铝,轻轻敲管壁使氧化铝层
填实、无空隙,顶面平齐,再同样装入5~6cm的硅镁型吸附剂,上面再装入5~6cm无水硫
酸钠,用30ml环己烷淋洗装好的层析柱,待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。
4.2.2 将样品环己烷提取液倒入层析柱中,打开活塞,调节流速为每分钟1ml,必要时可用
适当方法加压,待环己烷液面下降至无水硫酸钠层时,用30ml苯洗脱,此时应在紫外光灯下
观察,以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止,如30ml苯不足时,可适当增加苯量。收
集苯液于50~60℃水浴上减压浓缩至0.1~0.5ml(可根据样品中苯并(a)芘含量而定,应注
意不可蒸干)。
4.3 分离
4.3.1 在乙酰化滤纸条上的一端5cm处,用铅笔划一横线为起始线,吸取一定量净化后的
浓缩液,点于滤纸条上,用电吹风从纸条背面吹冷风,使溶剂挥散,同时点20μl苯并(a)
芘的标准使用液(1μg/ml),点样时斑点的直径不超过3mm,层析缸(筒)内盛有展开剂,滤
纸条下端浸入展开剂约1cm,待溶剂前沿至约20cm时取出阴干。
4.3.2 在365或254nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条用铅笔划出标准苯并(a)芘及与其同
一位置的样品的蓝紫色斑点,剪下此斑点分别放入小比色管中,各加4ml苯加盖,插入50~
60℃水浴中不时振摇,浸泡15min。
4.4 测定
4.4.1 将样品及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中,以365nm为激发光
波长, 以365~460nm波长进行荧光扫描,所得荧光光谱与标准苯并(a)芘的荧光光谱比较
定性。
4.4.2 与样品分析的同时做试剂空白, 包括处理样品所用的全部试剂同样操作,分别读
取样品、标准及试剂空白于波长406、406+5、406-5nm处的荧光强度,按基线法由式(1)
计算所得的数值,为定量计算的荧光强度。


F = F406 - (F401 + F411)/2................(1)


4.5 计算
S1/F × (F1-F2) × 1000
X1 = ─────────────── .............(2)
m × V2/V1
式中:X1——样品中苯并(a)芘的含量,μg/kg;
   S1—─苯并(a)芘标准斑点的含量,μg;
    F—─标准的斑点浸出液荧光强度;
   F1—─样品斑点浸出液荧光强度;
   F2—─试剂空白浸出液荧光强度;
   V1—─样品浓缩液体积,ml;
   V2—─点样体积,ml;
    m——样品质量,g。


第二法 目测比色法


5 原理
  样品经提取、净化后于乙酰化滤纸上层析分离苯并(a)芘,分离出的苯并(a)芘斑点,
在波长365nm的紫外灯光下观察,与标准斑点进行目测比色概略定量。
6 试剂
   同2.1~2.14。
7 仪器
   同3.1~3.7。
8 操作方法
8.1 样品提取:按4.1.1~4.1.6的方法操作。
8.2 净化:按4.2.1~4.2.2的方法操作。
8.3 测定
8.3.1 吸取5、10、15、20或50 μl样品浓缩液(可根据样品中苯并(a)芘含量而定)10、
20μl及苯并(a)芘标准使用液(0.1μg/ml),点于同一条乙酰化滤纸上。按4.3.1展开,
取出阴干。
8.3.2 于暗室紫外灯下目测比较,找出相当于标准斑点荧光强度的样品浓缩液体积,如
样品含量太高,可稀释后再重点,尽量使样品浓度在两个标准斑点之间。
8.4 计算
S2×1000
        X2 = ───────..........................(3)
m×V2/V1
 式中:X2——样品中苯并(a)芘的含量,μg/kg;
    S2——样品斑点相当苯并(a)芘的含量,μg;
    V1——样品浓缩总体积,ml;
    V2——点样体积,ml;
    m—─样品质量,g。
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